Anschlussprojekte | Sonderprojekte

Förderbeginn 01.07.2016

Ein mikrofluidisches Lab-on-a-Chip System zur Analyse von Cholera Infektionen

Prof. Dr. Kai Papenfort
Ludwig-Maximilians-Universität München
Biocenter, Microbiology

Prof. Dr. Albert Siryaporn
University of California, Irvine
Department of Physics


Cholera ist eine schwere bakterielle Infektionskrankheit, die durch das Bakterium Vibrio cholerae verursacht wird. Vibrio cholerae ist spezifisch für den Menschen und folglich sind Tiermodelle, welche die Wechselwirkung von V. cholerae mit den Zellen des Dünndarmes simulieren nur begrenzt zur Entwicklung neuer Therapeutika zu gebrauchen. Zwei konvergierende Zell-Zell-Kommunikationswege steuern Virulenz von V. cholerae und unsere vorläufigen Daten zeigen, dass ein dritter, parallel wirkender Kommunikationsweg existiert. Hier wirkt der VqmA Transkriptionsfaktor als Rezeptor eines neuen Signalmoleküls, dass von Bakterien und eukaryotischen Zellen hergestellt wird. Dieses Moleküls aktiviert VqmA, was wiederum die Transkription einer kleinen regulatorischen RNA (VqmR) kontrolliert. VqmR unterdrückt die Toxinproduktion und die Biofilmbildung von V. cholerae und ist daher relevant für den Infektionsprozess. In diesem Projekt werden wir die biologische Rolle dieses neuen Signalmoleküls mittles Mikrofluidik-Chips untersuchen.

Abschlussbericht
Aktivitäten

Die Virulenz des bedeutenden Humanpathogens Vibrio cholerae hängt stark von seiner Fähigkeit ab Biofilme zu bilden und Virulenzgene zu exprimieren. Dieser komplexe Prozess wird von mehreren Faktoren bestimmt, darunter ein neu entdecktes Kommunikationsmolekül namens DPO (3,5-Dimethylpyrazin-2-ol). Im Kontext dieses BaCaTec-Projekts haben wir die Rolle von DPO in der Biofilmbildung und Virulenzgenexpression von V. cholerae untersucht. Diese fruchtbare Zusammenarbeit zwischen der Papenfort-Gruppe an der LMU in München und der Siryaporn-Gruppe an der UC Irvine ermöglichte es uns, die methodischen Stärken beider Labore zu bündeln.

In der AG Papenfort haben wir verschiedene V. cholerae-Stämme generiert und charakterisiert, denen jeweils eine oder mehrere Komponenten des DPO-abhängigen Zell-Zell-Kommunikationsweges fehlten. Dadurch war es uns möglich, DPO-Synthese und Wahrnehmung voneinander zu trennen, indem wir Stämme verwendeten, die in der Lage waren, DPO zu detektieren, aber es nicht selbst erzeugten. Durch Einbringen verschiedener Gene für fluoreszierende Proteine in diese Stämme konnten wir gleichzeitig mehrere markierte Stämme in einem einzigen Biofilm wachsen lassen und ihre individuellen Beiträge zur Biofilmbildung bewerten.

Im Siryaporn-Labor nutzten wir den etablierten Workflow für die Herstellung und Anwendung mikrofluidischer Chips, um die verschiedenen V. cholerae-Stämme in einer realistischen Umgebung zu untersuchen. Mit dieser Methode konnten wir V. cholerae-Biofilme auf Glasobjektträgern in einem konstanten Mediumstrom kultivieren und gleichzeitig die sich entwickelnde mikrobielle Gemeinschaft mittels Fluoreszenzmikroskopie verfolgen.

Ergebnisse

Wir konnten die Wirkung von DPO auf die Genexpression von V. cholerae unter Verwendung der oben erwähnten Reporter zeigen. Mit verschiedenen Designs für die mikrofluidischen Chips konnten wir eine Verbindung zwischen Durchflussrate, Biofilm-Lokalisierung und Fluoreszenz-Output herstellen. Insbesondere bei der Verwendung verzweigter Kanäle, die die Strukturen im menschlichen Darm nachahmten, beobachteten wir eine unterschiedliche Aktivität des Systems zwischen dem Hauptkanal, wo Kommunikationsmoleküle durch den Mediumstrom konstant entfernt werden, und den Seitenkanälen, wo begrenzte Flussraten zur Akkumulation von DPO und somit zur Induktion des Kommunikationssystems führten.

Wir untersuchten auch den Einfluss verschiedener Komponenten des Systems auf die Fähigkeit von V. cholerae, Biofilme zu bilden. In Übereinstimmung mit unseren bisherigen Ergebnissen hob die Mutation des DPO-Rezeptors VqmA die inhibitorische Wirkung von DPO auf die Biofilmbildung vollständig auf. Folglich konnten sich Stämme, denen vqmA fehlte, während einer Co-Kultivierung gegen die entsprechenden Wildtypstämme durchsetzen.

Besonders hervorheben möchten wir die Verwendung der aus diesem Projekt gewonnenen Daten für den Antrag auf einen ERC Starting Grant (2017) durch die AG Papenfort. Der Antrag war erfolgreich und das Projekt konnte im Januar 2018 begonnen werden.

Ausblick

Seit dem ersten BaCaTeC-Projekt besteht eine fortlaufende Zusammenarbeit zwischen unseren Laboren. Unser aktueller Fokus liegt auf der Untersuchung der Bedeutung von anderen mikrobiellen Spezies im Kommunikationsprozess, da V. cholerae während seines Infektionszyklus mit anderen Darmbakterien in intensivem Wettbewerb steht. Die Untersuchung des Einflusses kommensaler Mikroben auf Biofilmbildung und DPO-Signaltransduktion wird wichtige Einblicke in die Pathogenität von V. cholerae liefern und die Rolle der mikrobiellen Kommunikation während dieses Prozesses aufzeigen.