Förderprojekte

Förderbeginn 01.01.2001

Entwicklung von Krankheitsspezifischen cDNA Arrays

PD Dr. med. Ulf Müller-Ladner
Universität Regensburg
Klinik und Poliklinik für Innere Medizin I

PD Dr. med. Frank Kullmann
Universität Regensburg
Klinik und Poliklinik für Innere Medizin I

Prof. Dr. Michael McClelland
Sidney Kimmel Cancer Center
Moleculare Biology

Dr. John Welsh
Sidney Kimmel Cancer Center
Moleculare Biology

Frühe Diagnosemöglichkeiten sind für Prävention und Therapie von malignen und chronisch-entzündlichen Erkrankungen essentiell. Da Marker für diese Krankheitsphasen weitgehend fehlen. besteht das Ziel dieses Projektes darin, mittels eines 'multi-gen chip cDNA array' krankheitsspezifische cDNA für diese Erkrankungen zu entwickeln. Hierzu soll die vor kurzem im Labor von Dr. M. McClelland im Sidney Kimmel Cancer Center (La Jolla, CA) entwickelte Multi-Gen Array Technik eingesetzt werden. In einer Pilotstudie sollen im Förderungszeitraum ausgewählte Proben von Patienten mit Kolonkarzinom und rheumatoider Arthritis mit dieser Technik untersucht werden, um so möglicherweise die Voraussetzungen für ein neues Detektionssystem für prämaligne Erkrankungen oder frühe Stadien chronisch-entzündlicher Erkrankungen zu schaffen.

Abschlussbericht
Ziel dieses Projektes war es, Microarrays zu entwickeln, mit deren Hilfe nicht wie bei herkömmlichen („horizontalen“) Arrays die Expression tausender Gene in einigen wenigen Proben, sondern die Expression einiger Dutzend Gene in Hunderten bis Tausenden Patientenproben untersucht werden kann. Denn gerade im Bereich komplexer Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis (RA) ist es nicht hinreichend, nur einige Patienten zu untersuchen, um einen guten Überblick über die krankheitsspezifische Genexpression zu erhalten. Andererseits wurden bereits etliche Kandidatengene identifiziert, deren Expression in grösseren Patientenkollektiven lohnend erscheint, eine globale Genexpressionsanalyse ist somit nicht unbedingt notwendig.

Der theoretisch einfachste Ansatz, das Aufbringen je einer Gesamt-cDNA-Probe pro Patient auf den Array, liefert leider kein Hybridisierungssignal, da die Probe deutlich zu komplex ist (u.U. mehrere 10.000 unterschiedliche Sequenzen). Jede einzelne Sequenz ist daher zu selten repräsentiert, um detektiert werden zu können.

Um die Komplexität der Proben zu verringern und zugleich eine Amplifikation der vorhandenen DNA unter Beibehaltung der relativen Mengenverhältnisse zu erreichen, bedienten wir uns der von Profs. Welsh und McClelland entwickelten RAP-PCR (1) (RNA arbitrarily primed polymerase chain reaction). Dieses Verfahren ermöglicht es, mit Hilfe verschiedener kurzer, arbiträrer Primer jeweils eine Teilmenge der vorhandenen cDNA zu amplifizieren.

Im Rahmen des von BaCaTec geförderten ersten Teils dieses Projektes sollten zunächst grundlegende Parameter etabliert werden, um das Projekt später auf grössere Patientenzahlen ausweiten zu können. Hierfür wurde cDNA von 20 Patienten mit 23 verschiedenen Primern amplifiziert und mit einem spotting robot auf Aminosilan-beschichtete Objektträger aufgebracht. Sodann wurden für mehrere Gene fluoreszenzmarkierte Sonden hergestellt. Dies wurde zunächst mittels PCR versucht, es zeigte sich jedoch, dass doppelsträngige DNA-Sonden hier ungeeignet sind. In der Folge wurden mittels in vitro-Transkription einzelsträngige RNA-Sonden hergestellt, die deutlich bessere Hybridisierungsergebnisse erbrachten. Diese Sonden wurden mit den Arrays hybridisiert, um die Expression der entsprechenden Gene nachzuweisen.

Im Förderzeitraum konnte gezeigt werden, dass die Methode grundsätzlich durchführbar ist und die erwarteten Ergebnisse liefert. Das Verfahren wurde in einem zweijährigen, von der Leopoldina geförderten Projekt ebenfalls von Dr. Martin Judex in San Diego weiter optimiert sowie zur Verarbeitung grösserer Probenmengen unter Verwendung eines Pipettierroboters weitgehend automatisiert.

Literatur:

(1) Rondeau G, McClelland M, Nguyen T, Risques R, Wang Y, Judex M, Cho AH, Welsh J. Enhanced microarray performance using low complexity representations of the transcriptome. Nucleic Acids Res. 2005 Jun 24;33(11)

Eine weitere Veröffentlichung ist in Vorbereitung.