Förderprojekte

Förderbeginn 01.07.2005

Zuverlässige Hochdurchsatz-Technologien zur Quantifizierung von Pathogenen in Umweltproben

Dr. Michael Lebuhn
Technische Universität München
Institut für Wasserqualitätskontrolle Waste Management (WGA)

Prof. Dr. Stefan Wuertz
University of California, Davis
Department of Civil & Environ. Engineering (DCEE)

Das Konzept der mikrobiellen Indikatoren für fäkale Verunreinigungen ist für viele Umweltszenarien nicht anwendbar, wenn die öffentliche Gesundheit geschützt werden soll. Indikatororganismen können präsent sein aber keine Pathogene und umgekehrt. Die Kooperation beinhaltet die gemeinsame Entwicklung molekularer und Ultrafiltrations-Technologien, um Pathogene (z.B. Humanes Adenovirus 40/41, Enteroviren, pathogene Protozoen) in wässrigen Umweltproben zu quantifizieren. TUM-WGA (Technische Universität München, Lehrstuhl für Wassergüte- und Abfallwirtschaft, Dr. M. Lebuhn) wird hocheffiziente Extraktionssysteme für Nukleinsäuren und spezifische und sensitive (Reverse Transkription) quantitative Echtzeit-PCR-Ansätze zur Quantifizierung von Pathogenen in Gegenwart von PCR-Inhibitoren entwickeln. Konventionelle Indikatoren werden parallel bestimmt. UCD-DCEE (Universität von Kalifornien, Davis, Abteilung für Ziviles & Umwelt-Ingenieurwesen, Prof. S. Wuertz) wird geeignete Konzentrations- und Ultrafiltrations-Methoden für wässrige Proben mit großen Volumina entwickeln. Die Entwicklung geeigneter Hi-Tech-Ansätze und die Identifizierung geeigneter Indikatoren und Konzentrations-Niveaus soll helfen, Richtlinien zur Güte von Badegewässern zu verbessern.

Abschlussbericht
Die Effizienz kommerzieller DNE-Extraktionskits (FastDNA® spin kit for soil (1), QIAamp stool mini kit (2), modified QIAamp maxi spin kit (3)) wurde in einem transkontinentalen „microbial source tracking“ (MST) Ansatz evaluiert. Dabei wurden vier quantitative Real-Time PCR (qPCR) Bacteroidales Assays (universell, Rind-, Hund- und Menschen-spezifisch) eingesetzt und auf transkontinentale Spezifität getestet. Die qPCR-Assays wurden mit jeweils 3 Feces-Proben von Rindern, Hunden und Katzen und Proben eines Kläranlagen-Zuflusses (für Menschen-Bacteroidales) getestet sowie mit Proben nach der UV-Behandlung. Weiterhin wurden Proben stromauf- und -abwärts der Kläranlagen-Einleitung in den Fluss Isar untersucht, um deren Wirkung und die Hauptquelle fäkaler Kontamination abzuklären. Ein neuartiges Hohlfaser-Ultrafiltrations-System wurde erfolgreich zur Konzentrierung von Bakterien in Flusswasser eingesetzt.

Mit einer DNA-Wiederfindungsrate von 93 % war Methode (1) gegenüber 35 % (Methode 2) und 17 % (Methode 3) am effektivsten und eignete sich am besten zur Quantifizierung von Bacteroidales spp. in der nachfolgenden qPCR. Für die relativ reinen Flusswasserproben konnte der Extraktionsschritt auch weggelassen werden. Eine eventuelle PCR-Inhibierung konnte in einer Vorlagen-Verdünnungsreihe aufgedeckt werden. Die Bestimmung des Ausmaßes und der Quelle fäkaler Verunreinigung in Umweltproben ist also von der Wahl der DNA-Extraktionsmethode beeinflusst. Die Detektionsgrenze lag bei 20 – 30 Genkopien / qPCR-Reaktion. Erwartungsgemäß wurde die geringste Menschen-Bacteroidales-Konzentration stromaufwärts der Kläranlagen-Einleitung gefunden und die höchste im Kläranlagen-Zulauf. DNA der Menschen-Bacteroidales wurde auch nach der UV-Behandlung nachgewiesen.

10⁷ – 10¹¹ Genkopien / g Trockensubstanz wurden in den Proben mit den entsprechenden Wirt-spezifischen qPCR-Assays gemessen. Allerdings reagierte der Menschen-spezifischen Assay auch unspezifisch mit einer Rinder- und einer Katzen-Fecesprobe. Wegen der genetischen Variabilität der Ziel-DNA muss die Spezifität der Genotyp-Assays für einen transkontinentalen Einsatz verbessert werden.