Förderprojekte

Förderbeginn 01.07.2005

Einfluss der Bindung von Integrase und RT auf die Initiierung der reversen Transkription

Dr. Hauke Walter
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Lehrstuhl für Klinische Virologie

Agnes Föglein
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Lehrstuhl für Klinische Virologie

Prof. Dr. Samson A. Chow
University of Southern California, Los Angeles
School of Medicine, Department of Molecular and Medical Pharmacology

Auf der Suche nach Medikamenten gegen die weltweit verbreitete HIV-Infektion, ist die virale reverse Transkriptase (RT) schon lange ein wesentliches Ziel der antiretroviralen Therapie. Die RT ist aktiv in der frühen Phase des retroviralen Replikationszyklus und Bestandteil des sogenannten Präintegrations-Komplexes, dessen zweiter viraler Hauptbestandteil die Integrase ist, die schließlich die Integration der viralen DNA in das Wirtszellgenom vornimmt. Erste Experimente mit einer C-terminal mutierten Integrase zeigten, dass die Protein-Bindung zwischen RT und Integrase nicht mehr besteht, aber in vitro die Aktivität der Integrase und der RT jeweils erhalten war. Dennoch konnten HI-Viren mit dieser Integrase nach Infektion keine reverse Transkription mehr durchführen. Ziel des Projekts ist es, zu zeigen inwieweit die Expression des C-terminalen Teils der Integrasemutante inhibitorisch wirksam ist, und so ob die Bindung zwischen Integrase und RT essentiell für die Initiierung der viralen Replikation ist.

Abschlussbericht
Eines der bedeutenden ersten Schritte im Replikationszyklus von HIV ist die reverse Transkription der viralen RNA in cDNA welche anschließen in das Genom der Wirtszelle integriert werden kann. Ziel des Projekts ist es die Interaktion zwischen des HIV-1 Proteins Integrase(IN) und reverse Transkriptase(RT) zu untersuchen, genauso genommen festzustellen welche Rolle die einzelnen Domänen von IN bei dieser Interaktion spielen. RT kann in vitro auch in Abwesenheit von IN reverse Transkription durchführen, in Zellkultur jedoch ist die Anwesenheit von IN essentiell. Eine bekannte Bindestelle zwischen RT und der c-terminalen Domäne von IN wurde identifiziert welche für die IN-abhängige RT-Aktivität essentiell ist, allerdings können auch Mutationen ausserhalb dieses Bereiches dazu führen dass die RT Funktion gestört wird. Die Arbeitsgruppe um Dr. Chow hat die C130S IN-Mutante generiert mit einem Cystein zu Serin Austausch an Stelle 130 in der Kern-Domäne. Obwohl diese Mutation nicht direkt die RT-Bindestelle betrifft, führte diese Mutation zu einem Verlust der reversen Transkription in der Zellkultur.

Die Frage die untersucht werden sollte war, was genau an IN notwendig für die reverse Transkription ist. Es ist interessant zu wissen wie IN in vivo die reverse Transkription fördert und ob die physikalische Interaktion nötig ist oder andere Teile von IN wichtig sind. Um zu untersuchen welche Bedeutung einzelne Domänen von IN haben, wurden diese als Vpr-Fusionskonstrukte in Vektoren kloniert. Die Fusion zu Vpr sollte sicher stellen, dass die IN-Fragmente ins Virion verpackt werden während die Protease-Schnittstelle zwischen Vpr und IN bewirkte dass das Fragment während der viralen Reifung freigesetzt werden konnte. Es wurden Vektoren für folgende IN-Fragmente hergestellt: C-terminal, ΔC and ΔN and WT-IN. Diese Vektoren wurden co-tranfiziert entweder mit C130S oder ΔIN Virus – einem Virusplasmid bei dem Stoppmutationen zu Beginn der Integrasesequenz eingefügt wurden um die Integraseexpression zu unterbinden. Westernblotanalyse vom aus dem Überstand gesammelten Virus konnte beweisen dass die IN-Deletionsmutante tatsächlich keine IN herstellte und die verschiedenen Kombinationen trotzdem Viruspartikel produzierten. Durch Extraktion der Gesamt-DNA von mit Virus infizierten Zellen mit anschließender quantitativer RT-PCR für die Produkte der frühen reversen Transkription kann in folgenden Versuchen festgestellt werden inwiefern eine Komplementierung mit einzelnen Fragmenten möglich ist und dementsprechend welche Bereiche besonders wichtig sind.

Die Infektion mit ΔIN Virus und Fragmenten von IN sollte in nur einer Infektionsrunde enden, möglicherweise auch ohne reverse Transkription abhängig davon ob die Fragmente die benötigte IN-Funktion ersetzen können. Die Experimente erlauben zu bestimmen ob einzelne Domänen genug sind um die reverse Transkription wiederherzustellen und veranschaulichen dadurch welche IN-Teile dafür nötig sind. Andererseits helfen Experimente bei denen der C130S Virus mit den IN-Fragmenten cotransfiziert wird dabei, den Einfluss der Mutation auf die Zusammenarbeit von IN und RT zu verstehen. Wenn das zur Verfügung stellen von einer unveränderten Kern-domäne die reverse Transkription wieder herstellt, weiß man dass auch dieser Teil der IN eine wichtige Aufgabe bei der Interaktion hat. Sollte jedoch allein die c-terminale Domäne dazu ausreichen die reverse Transkription wieder herzustellen würde das darauf hinweisen, dass die untersuchte Mutation über ihren Einfluss auf den c-terminus der IN ihre Wirkung erzielt. Dies soll in anschließenden Versuchen untersucht werden.