Anschlussprojekte | Sonderprojekte

Förderbeginn 01.07.2003

Entwicklung eines fluoreszenzbasierten Testsystems zur Untersuchung der Aktivierungsmechanismen von G-Protein gekoppelten Rezeptoren

Dr. Carsten Hoffmann
Universität Würzburg
Institut für Pharmakologie und Toxikologie

Prof. Dr. Mark H. Ellisman
University of California, San Diego
National Center for Microscopy and Imaging Research, Biomedical Informatics R.


Im Rahmen der Förderung dieses Antrages soll ein System entwickelt werden, mit dessen Hilfe sich Konformationsänderungen von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren messen lassen, die durch Liganden induziert werden. Durch molekularbiologische Techniken soll dazu zunächst ein genetisch codierter Fluorophor (GFP) in einen Rezeptor eingebracht werden. Für einen zweiten Fluorophor soll, ebenfalls durch molekularbiologische Techniken, an geeigneter Stelle eine Bindungsstelle erzeugt werden. Durch zweckmäßige Auswahl der Fluorophore kann dabei einer der beiden Fluorophore durch die Emission des anderen angeregt werden. Dieser Vorgang wird auch als Fluoreszenzresonanzenergietransfer oder kurz FRET bezeichnet. Die Stärke des Energietransfers ist dabei abhängig von der Distanz zwischen beiden Partnern. Bedingt durch eine Konformationsänderung des Rezeptors während der Aktivierung durch einen Agonisten soll es zu einer Distanzänderung zwischen beiden Fluorophoren kommen, die dann als eine Änderung des Signals gemessen werden kann. Die Vorteile dieses Systems gegenüber bisherigen Techniken wären die Anwendbarkeit in lebenden Zellen und bedingt durch die Verwendung eines kleinen Fluorophors als Bewegungssensor sollte zudem die Erfassung schneller Aktivierungskinetiken möglich werden.

Abschlussbericht
G-Protein gekoppelte Rezeptoren übertragen die Information eines extrazellulär bindenden Liganden über die Zellmembran in das Zellinnere. Dieser Aktivierungsvorgang wird durch eine Veränderung der Konformation des Rezeptors bewerkstelligt. Im Rahmen des Projektes gelang es ein Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe sich Konformationsänderungen von G-Protein gekoppelten Rezeptoren in lebenden Zellen optisch messen lassen. Die zeitliche Auflösung wird dabei im Millisekundenbereich erreicht. Die optische Messung basiert auf dem Phänomen des Fluoreszenz Resonanz Energie Transfers (FRET). Dabei wird Energie zwischen zwei räumlich nahen Fluorophoren ausgetauscht und die Intensität des Transfers ist abhängig vom Abstand der Fluorophore. In dem Projekt wurde dazu eine neuartige Kombination eines kleinen löslichen Fluoreszenzfarbstoffs (FlAsH), der an eine spezifische sechs Aminosäuren lange Proteinsequenz bindet, mit dem cyanfarbenem Fluoreszenz Protein verwirklicht und in einem dynamischen FRET Experiment erfolgreich gemessen. Wir konnten zweigen, dass sich mit diesem Verfahren nicht nur Konformationsänderungen in lebenden Zellen messen lassen, sondern sich durch die Verwendung eines kleinen Fluorophores auch die pharmakologischen Eigenschaften des Rezeptors nicht ändern, ganz im Gegensatz zur Verwendung großer Fluorphore. Damit ist es denkbar solche Verfahren nicht nur in der Grundlagenforschung, sondern langfristig auch in einer Phase der Wirkstofffindung in der Industrie einzusetzen. Die Möglichkeiten dieser neuartigen Fluorophorkombination werden derzeit in weiteren Projekten untersucht und sind eine direkte Folge der Förderung des Projektes durch BaCaTeC.