Anschlussprojekte | Sonderprojekte

Förderbeginn 01.07.2008

Proteinanalyse von einzelnen Neuronen nach Lasermikrodissektion

Dr. med. Andreas Bender
Ludwig-Maximilians-Universität München
Neurologische Klinik und Poliklinik im Klinikum München - Großhadern

Dr. Elizier Masliah
University of California, San Diego
Neurosciences / MTF 348


Bei der Parkinson-Erkrankung kommt es neuropathologisch zu einer Anhäufung des Proteins α-Synuclein in Mittelhirnneuronen. In Vorarbeiten konnten wir bereits auf Einzelzellebene nach Lasermikrodissektion (LMD) zeigen, dass es hierbei auch zu Mutationen der mitochochondrialen DNA und zu einer Störung des Energiestoffwechsels kommt. Für das Verständnis der beteiligten Pathomechanismen ist es erforderlich auch die Proteinexpression der betroffenen Zellen zu untersuchen. Hierzu werden wir im Rahmen des geförderten Projektes entsprechende Hirnschnitte eines Parkinson-Mausmodelles färben und mittels einer semiautomatisierten Mustererkennungs-Software ca. 100 bis 1000 betroffenen Neurone durch LMD ausschneiden und auffangen. Es soll eine hochsensitive Western-Blot-Methode entwickelt werden, um im Anschluss an die Proteinextraktion gezielt die Quantität von Proteinen der mitochondrialen Atmungskette analysieren zu können. Diese Methodik wird wichtige Erkenntnisse nicht nur für das Verständnis von neurodegenerativen Erkrankungen sondern auch von weiteren Zellart-spezifischen Störungen liefern.

Abschlussbericht
Mitochondriale Veränderungen sowie Proteinablagerungen scheinen eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Parkinson-Erkrankung zu spielen. Wir konnten bereits zeigen, dass es in einzelnen Neuronen der Substantia nigra von Parkinson-Patienten zu einer Akkumulation von Mutationen der mitochondrialen DNA kommt. Hierzu verwendeten wir die Methode der Lasermikrodissektion (LMD), um einzelne Neurone aus postmortem Hirnschnitten mit quantitativen PCR-Methoden zu untersuchen. Für die weitere Analyse der zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen ist es jedoch notwenig nicht nur auf DNA- sondern auch auf Proteinebene die von der Erkrankung betroffenen Neuronenpopulationen zu untersuchen. In dem hier geförderten Projekt entwickelten wir daher eine Methode, um mittels LMD und hochsensitivem Western-Blot die Proteinexpression einzelner postmortem Neurone zu quantifizieren.

Hierzu verwendeten wir Gefrierschnitte von transgenen Parkinson-Mausmodellen, von humanen Kontrollen sowie von Muskelbiopsien. Mittels LMD konnten wir das Schlüsselenzym des Dopaminstoffwechsles, Tyrosin-Hydroxylase (TH) in gepoolten humanen Substantia nigra Neuronen auf Proteinebene darstellen. Durch Analyse von Gliazellen, die keine TH enthalten, konnten wir die Spezifität der Methode nachweisen. In Muskelschnitten konnten Komplexe der Atmungskette mittels Western-Blot quantifiziert werden.

Durch das hier geförderte Projekt war es möglich auf gepoolter Einzelzelleben verlässlich Proteine zu quantifizieren, die aus ca. 200 Zellen mittels LMD gewonnen worden waren. Diese Methode ist aus Sicht der Antragsteller ein wichtiger Baustein in der weiteren Entschlüsselung der molekularen Pathomechanismen neurodegenerativer Erkrankungen, da sie es erlaubt hochspezifisch die jeweils betroffenen Zellpopulationen zu analysieren.

Die Projektarbeit hat zur Veröffentlichung in einer internationalen Fachzeitschrift geführt:

Koob AO, Bruns L, Prassler C, Masliah E, Klopstock T, Bender A. Protein analysis through Western blot of cells excised individually from human brain and muscle tissue. Anal Biochem. 2012 Jun 15;425(2):120-4. doi:10.1016/j.ab.2012.02.034. Epub 2012 Mar 5. PubMed PMID: 22402104.