Förderprojekte

Förderbeginn 01.01.2011

Proteinstruktur und Aktivierungsmechanismus der Kälte-aktivierten Proteinkinase A (PKA) des tropischen Krankheitserregers Trypanosoma

Prof. Dr. Michael Boshart
Ludwig-Maximilians-Universität München
Fakultät für Biologie - Department Biologie I - Genetik

Prof. Susan S. Taylor
University of California, San Diego
Howard Hughes Medical Institute

Die Proteinkinase A (PKA) ist ein zentraler Regulator für viele Prozesse in menschlichen und tierischen Zellen und wird durch den intrazellulären Botenstoff cAMP aktiviert. Die PKA des Parasiten Trypanosoma, dem durch Tsetse-Fliegen übertragenen Erreger der Afrikanischen Schlafkrankheit, stellt eine Ausnahme dar, da sie nicht durch cAMP sondern durch Kälteschock aktiviert wird. Ein solcher Temperaturabfall tritt in der Natur bei der Übertragung der Parasiten auf und ist wichtig für die Differenzierung von der Säuger- zur Insektenform der Trypanosomen. In dem geförderten Projekt soll die Kristallstruktur der Parasiten-PKA gelöst werden, um durch Vergleiche mit der Säuger-PKA die Funktionsweise des ungewöhnlichen Kälteschock-Aktivierungsmechanismus und die Bedeutung für den Parasiten-Lebenszyklus zu untersuchen. Die Kollaboration wird die Expertise des Labors von Prof. Susan Taylor (San Diego) auf dem Gebiet der PKA-Biochemie und Strukturbiologie mit der des Labors von Prof. Michael Boshart (München) auf dem Gebiet der Trypanosomen-Genetik verbinden. Es werden Erkenntnisse zur Evolution der PKA und des cAMP-Signalsystems erwartet. Die Parasiten-PKA kommt als Zielstruktur für neue Wirkstoffe in Frage, die zur Therapie vernachlässigter Tropenkrankheiten dringend benötigt werden.

Abschlussbericht
Das Projekt sollte Strukturdaten liefern um die ungewöhnliche durch Kälteschock vermittelte Aktivierung einer cAMP-unabhängigen Proteinkinase A zu verstehen. Die Expression der regulatorischen Untereinheit PKAR war in München bereits weitgehend optimiert worden und mit Projektbeginn folgte im März 2011 ein 5-wöchiger Laboraufenthalt von Dr. Daniela Tonn in San Diego in dessen Verlauf verbesserte Reinigung, "Upscaling" und Kristallisationsansätze erreicht wurden. Folgeexperimente in San Diego lieferten aber keine brechenden Kristalle und wurden von der Taylor-Gruppe abgebrochen. In München konnten wir in der Folge das rekombinate R-C Holoenzym reinigen und Aktivierung/Bindung durch alternative Liganden zeigen. Das wirft ein ganz neues Licht auf die Evolution der PKA-Familie und ermöglichte spezifische pharmakologische Aktivierung der PKA von pathogenen Trypanosomen. Die Ligandenbindung war auch wichtig für Aktivierung der Kinase durch Kälteschock. Durch gerichtete Mutagenese der PKAR wurde die Bindung eines alternativen Liganden und die Bindungstaschen im Vergleich zur cAMP-Bindung der Säuger-PKA charakterisiert und modelliert. Nachdem wir erhebliche Fortschritte ohne Strukturdaten gemacht haben, sind diese nun umso aktueller um weiter zum Aktivierungsmechanismus durch Temperatur vorzudringen. Aus verschiedenen praktischen Gründen, nicht zuletzt der derzeitigen Fokussierung und Kapazitäten des Labors von S. Taylor haben wir die Strukturarbeiten aber mit einem lokalen Partner (MPI für Biochemie) wieder begonnen. Konsequenterweise haben wir trotz Projektverlängerung deshalb den Großteil der bewilligten BaCaTeC-Mittel zurückgegeben. Eine spätere Fortsetzung der Kooperation mit San Diego ist keinesfalls ausgeschlossen, da mit einer PKAR-Kristallstruktur von T. bruceia erst die eigentliche Arbeit beginnt, die unterschiedliche PKA-Aktivierung verschiedener Organismen und ihre strukturelle Basis vergleichend zu studieren.