Förderprojekte

Förderbeginn 01.07.2001

Anwendung genetisch modifizierter adulter neuraler Vorläuferzellen zur Regeneration traumatischer Rückenmarksverletzungen

Dr. med. Norbert Weidner
Universität Regensburg
Klinik und Poliklinik für Neurologie - Kliniknahe Grundlagenforschung

Dr. Armin Blesch
University of California, San Diego
Department of Neurosciences

Bisher existieren keine therapeutischen Strategien, welche die Regeneration nach traumatischer Rückenmarksverletzung fördern. Ziel des Projektes ist es, die strukturelle und funktionelle Erholung durch die Übertragung zellulärer und molekularer Komponenten in das verletzte Rückenmark zu fördern. Dazu werden adulte neurale Vorläuferzellen im Labor von Dr. Weidner an der Neurologischen Universitätsklinik Regensburg isoliert und in vitro vermehrt. Die genetische Modifizierung dieser Zellen mittels retroviraler Vektoren, welche die Differenzierung in einen besonders wachstumsfördernden Zelltyp bzw. die Expression wachstumsfördernder Faktoren induzieren, wird in Zusammenarbeit mit Dr. Tuszynski und Dr. Blesch in deren Labor am Department of Neurosciences der University of California, San Diego, durchgeführt. Schließlich soll die regenerative Kapazität derart genetisch modifizierter neuraler Vorläuferzellen in vivo nach traumatischer Querschnittsverletzung untersucht werden.

Abschlussbericht
A) Zusammenfassung und Bericht der bisherigen Ergebnisse des geförderten Vorhabens:

Primäres Ziel des o.g. Antrages war es, die in Regensburg etablierte neurale Stammzell-Technologie mit der an der University of California, San Diego (UCSD) entwickelten ex vivo Gen-Therapie zu kombinieren, um axonale Regeneration und funktionelle Wiederherstellung nach traumatischer Rückenmarkschädigung zu erzielen. Zu diesem Zweck unternahm zunächst der in der Arbeitsgruppe von Dr. Weidner beschäftigte biologische Doktorand, Herr Maurice Vroemen, einen Forschungsaufenthalt an der UCSD für den Zeitraum von 3 Monaten, um maßgeschneiderte retrovirale Vektoren zu entwickeln. Im Anschluss reiste Herr Dr. Weidner für weitere 3 Monate nach San Diego, um geplante tierexperimentelle Versuche (Transplantation, Verhaltenstestung) an der UCSD durchzuführen.
Der irreversible Gewebeuntergang nach spinalem Trauma stellt einen maßgeblichen Faktor dar, der Regeneration und damit funktionelle Erholung verhindert (Weidner and Blesch, 2002). Dabei gehen gliale Stützzellen und Nervenzellen zugrunde. Idealerweise sollten nun Zellen via Transplantation zugeführt werden, die untergegangenes Rückenmarksgewebe ersetzen können und eine zelluläre Leitschiene für wiederaussprossende Nervenbahnen bilden. Besonders geeignet hierfür sind adulte neurale Stammzellen, die sowohl in Glia als auch Neurone differenzieren können (Pfeifer et al., 2004). Im vorliegenden Antrag sollten adulte neurale Stammzellen gentechnisch modifiziert werden, mit dem Ziel, die Differenzierung in eine bestimmte gliale Subpopulation, sog. radiale Gliazellen, zu ermöglichen. Von radialen Gliazellen ist bekannt, dass sie während der Entwicklung des Zentralnervensystems eine zelluläre Leitstruktur sowohl für auswandernde Neurone als auch für deren Nervenfortsätze (Axone) bilden können.
Das Arbeitsprogramm des Antrages beinhaltete, zunächst adulte neurale Stammzellen gentechnisch mittels retroviraler Vektoren zu modifizieren, Transgene (Reporter-Gen GFP) stabil überzuexprimieren. In einem zweiten Schritt sollte das Transgen für aktiviertes Notch1 in Stammzellen überexprimiert werden, um dadurch die Differenzierung in radiale Gliazellen zu induzieren. Schließlich sollte die regenerative Kapazität radialer Gliazellen nach Transplantation in spinale Läsionen an der Ratte untersucht werden.
Im ersten Schritt es gelungen, sowohl mit Retroviren über einen internen EF-1alpha Promotor als auch mit Lentiviren über einen CMV/ß-actin Promotor adulte neurale Stammzellen mit hoher Effizienz zu transduzieren, das Reporter-Gen GFP zu exprimieren. Allerdings wurde die GFP-Expression nach Transplantation adulter neuraler Stammzellen in das Rückenmark der Ratte innerhalb von 7 Tagen zum großen Teil (in 70% der transplantierten Zellen) abgeschaltet. Nach 4 Wochen konnte das Transgen nur noch in 5% der transplantierten Stammzellen nachgewiesen werden. Das Abschalten des Transgens korrelierte eindeutig mit dem Maß des Differenzierungsgrades der Zellen. Welche molekularen Mechanismen dem beobachteten Phänomen des sog. "Transgene Silencing" zugrunde lagen, konnte bisher nicht geklärt werden. Diese Daten wurden jüngst veröffentlicht (Vroemen et al., 2005) Zusammengefaßt ist bisher lediglich eine zeitlich befristete Transgen-Expression gelungen, die nicht ausreicht, die Differenzierung mittels aktiviertem Notch 1 in radialer Glia zu erzielen. Das Problem des "Transgene Silencing" ist bisher nicht gelöst.
Gentherapeutische Ansätze sind nicht nur geeignet, die Differenzierung neuraler Stammzellen zu beeinflussen. Darüber hinaus können mittels Gentherapie Wachstumsfaktoren über lokale Überexpression vor Ort, d.h. im Bereich der Rückenmarksläsion, produziert werden. Da die Produktion von Wachstumsfaktoren über unmittelbar gentechnisch modifizierte neurale Stammzellen bisher nicht gelöst ist, wurde folgende Hypothese untersucht: Können neurale Stammzellen gemeinsam mit Fibroblasten transplantiert werden. Von Fibroblasten weiß man, dass sie problemlos gentechnisch modifizierbar sind, Wachstumsfaktoren stabil zu überexprimieren (Blesch et al., 1998). Wir haben deshalb zunächst die Ko-Transplantation nicht-modifizierter Fibroblasten mit adulten neuralen Stammzellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass Fibroblasten eine sehr gute zelluläre und azelluläre Matrix bilden, die neurale Stammzellen innerhalb des zystischen Läsionsdefektes halten können (Pfeifer et al., 2004). Derartige Ko-Transplantate aus neuralen Stammzellen und Fibroblasten steigern darüber hinaus signifikant die Nervenregeneration am spinalen Traumamodell der Ratte. In einem nächsten Schritt ist nun die Überexpression geeigneter Wachstumsfaktoren, z.B. Neurotrophin-3 (Grill et al., 1997), in gemeinsam mit neuralen Stammzellen ko-transplantierten Fibroblasten geplant. Auch dieses Follow-Up Projekt ist in enger Kooperation mit Prof. Armin Blesch von der University of California, San Diego, geplant.

B) Auflistung von Veröffentlichungen und Vorträgen aus der Projektförderung:

Originalpublikationen:
Vroemen M., Weidner N., Blesch A. (2005) Loss of gene expression in lentivirus- and retrovirus- transduced neural progenitor cells is correlated to migration and differentiation in the adult spinal cord. Exp. Neurol. in press. Pfeifer K., Vroemen M., Blesch A., Weidner N. (2004) Adult neural progenitor cells provide a permissive guiding substrate for corticospinal axon growth following spinal cord injury. Eur. J. Neurosci. 20: 1695-1704.

Übersichtsarbeiten:
Weidner N., Blesch A. (2002) Regenerative Strategien nach traumatischer Querschnittsverletzung. Aktuelle Neurologie 29: 223-272.

Kongressbeiträge (Vorträge, Posterpräsentationen):
K. Pfeifer, M. Vroemen, J. Winkler, A. Blesch, N. Weidner. (2002) Adult neural progenitor cells co-grafted with fibroblasts replace the lesion cyst and differentiate into astrocytes after spinal cord injury. Society for Neuroscience, Orlando, Florida, USA. Vroemen M., Blesch A., Weidner N. (2004) Ex vivo gene transfer into adult neural progenitor cells using retroviral and lentiviral vectors. Society for Neuroscience, San Diego, California, USA.

C) Aus der Förderung (bisher) resultierende Drittmitteleinwerbung (Förderinstitution, Dauer, Volumen, Bewilligungsdatum):

DFG-Antrag (Sachbeihilfe): Regenerative Kapazität adulter neuraler Vorläuferzellen im läsionierten Rückenmark adulter Ratten. Abgelehnt 2004.

D) Weitere Projektierung und Aussichten:

Anträge:
In Kooperation mit Prof. Armin Blesch: Christopher Reeve Foundation (USA): Co-transplantation of NT-3 overexpressing fibroblasts and adult neural stem cells for spinal cord repair.

Klinisch-wissenschaftliche Vernetzung:
Im Bereich des traumatischen Querschnitts ist derzeit keine klinische Anwendung experimenteller Therapiestrategien absehbar. Jedoch ist der Arbeitsgruppe gelungen, die Expertise bei zelltherapeutischen Strategien auf die Regeneration im peripheren Nervensystem zu übertragen. Gemeinsam mit Dr. Florian May von der Urologischen Klinik der TU München und wiederum Prof. Armin Blesch, UCSD, ist es gelungen, am Tiermodell durch Transplantation autologer Schwann-Zellen die strukturelle und funktionelle Wiederherstellung erektiler Nerven nach kompletter Transektion am Tiermodell der Ratte zu demonstrieren (May et al., 2004; May et al., 2005a; May et al., 2005b). Diese Regeneration konnte durch Einsatz gentechnisch modifizierter Schwann-Zellen deutlich gesteigert werden, die den Wachstumsfaktor Glial Cell-Line Derived Neutrophic Factor (GDNF) überexprimieren. Aktuell ist eine klinische Studie in Kooperation mit der Fa. InnovaCell (Innsbruck) zur Erprobung dieser zellbasierten Therapie geplant. Langfristig soll diese Therapie auch auf somatische periphere Nerven übertragen werden, um auch nach traumatischer Schädigung somatischer Nerven strukturelle und funktionelle Regeneration zu erzielen.

ANHANG:

Literatur
Blesch A, Grill RJ, Tuszynski MH (1998) Neurotrophin gene therapy in CNS models of trauma and degeneration. Prog Brain Res 117:473-484.
Grill R, Murai K, Blesch A, Gage FH, Tuszynski MH (1997) Cellular delivery of neurotrophin-3 promotes corticospinal axonal growth and partial functional recovery after spinal cord injury. J Neurosci 17:5560-5572.
May F, Schoeler S, Vroemen M, Matiasek K, Apprich M, Erhardt W, Hartung R, Gansbacher B, Weidner N (2005a) [Nerve repair strategies for restoration of erectile function after radical pelvic surgery.]. Urologe A 44:780-784.
May F, Weidner N, Matiasek K, Caspers C, Mrva T, Vroemen M, Henke J, Lehmer A, Schwaibold H, Erhardt W, Gansbacher B, Hartung R (2004) Schwann cell seeded guidance tubes restore erectile function after ablation of cavernous nerves in rats. J Urol 172:374-377.
May F, Vroemen M, Matiasek K, Henke J, Brill T, Lehmer A, Apprich M, Erhardt W, Schoeler S, Paul R, Blesch A, Hartung R, Gansbacher B, Weidner N (2005b) Nerve replacement strategies for cavernous nerves. Eur Urol 48:372-378.
Pfeifer K, Vroemen M, Blesch A, Weidner N (2004) Adult neural progenitor cells provide a permissive guiding substrate for corticospinal axon growth following spinal cord injury. Eur J Neurosci 20:1695-1704.
Vroemen M, Weidner N, Blesch A (2005) Loss of gene expression in lentivirus- and retrovirus-transduced neural progenitor cells is correlated to migration and differentiation in the adult spinal cord. Exp Neurol 195:127-139.
Weidner N, Blesch A (2002) Perspectives for regenerative strategies following spinal cord injury. Akt Neurol 29:223-228.