Anschlussprojekte | Sonderprojekte

Förderbeginn 01.07.2014

Elektro-optische Charakterisierung der Struktur-Funktions-Beziehungen in gesunder und erkrankter Muskulatur mit Hilfe subzellulärer Auflösungs-Technologien

Prof. Dr. Oliver Friedrich
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Lehrstuhl für Medizinische Biotechnologie

Prof. Dr. Julio Vergara
University of California, Los Angeles (UCLA)
David Geffen School of Medicine, Dept. of Physiology


Kombinierte elektrophysiologische/optische Ansätze können Eigenschaften und räumliche Verteilung von Ionenkonzentrationen und -Kanälen innerhalb der komplexen Muskel Zytoarchitektur auflösen. Dennoch werden experimentelle Anwendungen bisher wenig verfolgt, was unsere Möglichkeiten, gezielte therapeutische Ansätze zu entwickeln einschränkt. Hochleistungs-Bildgebungs-Technologien stellen neue Verfahren zur Verfügung, um (i) die räumliche Verteilung von Ionenkanal-Spezies direkt im T-System von Muskelzellen zu visualisieren und (ii) veränderte Expressionsmuster zu Umbauprozessen der Zytoarchitektur im Krankheitsfall zu korrelieren. In diesem Projekt setzen wir Hochleistungsmikroskopie ein, um die Ultrastruktur in lebenden Muskelzellen mittels „Second Harmonic Generation (SHG)“ zu quantifizieren. Ferner werden 3D-Immunfluoreszenz-Bildgebung und Elektrophysiologie-Verfahren eingesetzt, um die Veränderungen mit gezielten Ionenkanalklassen zu verknüpfen. Als Krankheitsmodell untersuchen wir Muskeln der mdx-Maus, da Duchenne Muskeldystrophie dafür bekannt ist, im chronisch progredienten Verlauf stark veränderte Zytoarchitektur und Morphologie zu produzieren.

Abschlussbericht
Im Verlauf des Projektes wurden Skelettmuskel-Zellen dystropher mdx Mäuse (Modell für menschliche Duchenne Muskeldystrophie) und Dystrophin-Utrophin doppel-knockout-Mutanten (schwerwiegenderer Phänotyp muriner Dystrophie) mit Multiphotonen-Second Harmonic Generation- (SHG) und –Fluoreszenz- Mikroskopie sowie elektrophysiologisch charakterisiert. Insbesondere war an Muskeln von adulten Tieren von Interesse, inwiefern sich die zelluläre Geometrie an der Schnittstelle der Erregungs-Kontraktions-Kopplung bei dem Mutationsmodell biophysikalisch verändert. Das transverso-tubuläre Erregungsnetzwerk wurde dabei mittels di-8-ANEPPS fluorometrisch vermessen, während das sarkomerische Myosin-Gerüst gleichzeitig mittels SHG vermessen wurde. Technologisch anspruchsvoll war die gleichzeitige Visualisierung von Calpain-GFP, welches mittels Elektroporation in vivo transfiziert wurde und an das Titin-Filament zwischen dem Myosin und der t-Tubulus-Region bindet. Um der strukturellen Aufhängung der Tubuli im Sarkomer-Gerüst näher zu kommen, wurden Muskelzellen bei unterschiedlicher Dehnung vermessen und die relativen Abstände für jeden Genotyp in Beziehung gesetzt. Wir finden in den Muskeln der Genotypen eine relativ gleichmässige Darstellung der Relativabstände der Strukturen mit der Sarkomerlänge (Dehnungszustand), was auf eine global erhaltene Aufhängung der Erregungs-Architektur in diesem Tiermodell schliessen läßt. Während des Projektes wurde ausserdem ein biotechnologisch-mechatronisches Force-Transducer-Aktor-System entwickelt, welches zur gleichzeitigen Messung von Rückstellkräften und Ultrastruktur im Multiphotonenmikroskop bei definierter Dehnung von Einzelzellen in der Folge eingesetzt werden wird.