Förderprojekte

Förderbeginn 01.07.2014

Onkolytische Vaccinia-Viren: Modelle für die zytosolische Genexpression und Virus-basierte Krebstherapie

Prof. Dr. Utz Fischer
Universität Würzburg
Biozentrum Universität Würzburg

Prof. Dr. Arno J. Mundt
University of California, San Diego
Radiation Oncology

Die Familie der Poxviridae zeichnet sich durch ein komplexes DNA Genom aus und hat großes medizinisches Potential. Am eindrucksvollsten ist dies für das Vaccinia-Virus belegt, welches nicht nur als Pocken-Impfstoff eingesetzt wird, sondern auch in der viralen Onkotherapie. Poxviridae haben einen sehr ungewöhnlichen Replikationszyklus, der auf das Zytoplasma der infizierten Zelle beschränkt ist. Die führt zu einem hohen Grad an Unabhängigkeit gegenüber der Wirtszelle, da diese die Transkription und Replikation nur im Zellkern unterstützt. In einer Zusammenarbeit mit dem Team von Prof. Mundt von der University of California, San Diego, werden wir die Genexpressions-Maschinerie des Vaccinia Virus auf molekularer Ebene untersuchen und damit u.a. eine Basis für die Entwicklung von neuen Virusstämmen für Krebstherapien legen.

Abschlussbericht
Dieses Verbundprojekt beschäftigt sich mit den Poxviridae, einer diversen Familie von komplexen DNA-Viren. Der prominenteste Vertreter dieser Familie ist das Vaccinia-Virus, welches weltweit als Pockenimpfstoff Verwendung fand und in den letzten Jahren auch zunehmend für virusbasierte Krebstherapien eingesetzt wird. Eine einzigartige Eigenschaft aller Poxiviridae ist deren ungewöhnlicher Replikationszyklus, der ausschließlich im Zytoplasma der infizierten Zelle stattfindet. Damit ist das Virus auf eigene Enzyme angewiesen, die sowohl die Transkription übernehmen als auch die Replikation steuern, da beides rein nukleäre Vorgänge im uninfizierten Host sind. Konsequenterweise codiert das Vaccinia-Virus (und alle anderen Poxviridae) diese Enzyme im eigenen Genom und ermöglicht somit eine zytosolische Genexpression.

In der von uns vorgeschlagenen Kooperation mit der Gruppe von Prof. Mundt (Radiation Oncology, UCSD) wollten wir die Biogenese und Funktion der Vaccinia-Virus RNA-Polymerase (vvRNAP) untersuchen. Hierbei handelt es sich um eine makromolekulare Maschine aus nicht weniger als neun Untereinheiten, die für die gesamte Genexpression des Virus verantwortlich ist. Die Kombination der jeweiligen Expertise beider Kooperationspartner wird uns auf diesem Feld signifikante neue Einblicke geben ermöglichen. Als Teil dieser Kooperation sollen junge Wissenschaftler an das interdisziplinäre Themengebiet theoretisch und praktisch herangeführt werden. Schließlich sollen die vereinten Forschungsanstrengungen zu einem Drittmittelantrag, entweder bei den NIH oder bei der DFG führen.

Ergebnisse aus der Förderperiode 2014/15:

Eine Schlüsselvoraussetzung für die strukturelle und funktionelle Untersuchung der Genexpressionsmaschinerie des Vaccinia-Virus war die Herstellung von rekombinanten Viren für diese Zwecke. Wir haben daher eine Kooperation zwischen einer Doktorandin aus dem Würzburger Labor (Kristina Bedenk) und einer etablierten Virusexpertin aus dem Labor an der UCSD (Dr. Qian Zhang) in die Wege geleitet. Dieses Team war in der Lage, die benötigten Virusstämme zu generieren und damit die experimentellen Voraussetzungen für das Projekt zu schaffen. Diese Stämme erwiesen sich dann als hervorragend geeignet, um die virale Genexpressionsmaschinerie zu isolieren und anschließend funktionell und strukturell zu untersuchen. Wir waren in der Lage, erstmals zu zeigen, dass vvRNAP einen stabilen Komplex mit diversen mRNA-Prozessierungsfaktoren ausbildet und eine funktionelle Transkriptions- und Prozessierungseinheit bildet. Überraschenderweise haben wir im Rahmen dieser Arbeiten auch noch weitere bislang unentdeckte Kofaktoren der viralen Transkriptionmaschinerie finden können. Deren funktionelle Analyse ist gegenwärtig in Arbeit.

Die Reinheit der isolierten Komplexe erlaubte auch erstmals deren strukturelle Analyse durch Röntgenkristallographie und Cryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM). In einer äußerst erfolgreichen Kooperation mit Kristallographen gelang uns die Lösung der atomaren Struktur einer neuen Komponente des Transkriptionsapparates. Darüber hinaus eröffnete die Zusammenarbeit mit den Cryo-EM-Experten in Edinburgh (UK) erste faszinierende Einblicke in die dreidimensionale Struktur der gesamten Transkriptionsmaschinerie. Diese Daten werden in Kürze zur Publikation eingereicht werden.

Basierend auf den Resultaten, die wir in den letzten zwei Jahren durch diese Kooperation erhalten haben, wurde im Oktober 2015 ein DFG-Antrag mit dem Titel „Assembly and structure of vaccinia virus RNA-polymerase” von UF eingereicht (Fi573/18-1). Die Entscheidung über die Förderung wird voraussichtlich im April 2016 bekanntgegeben.

Geplante zukünftige Arbeiten:

Wie aus der obigen Zusammenfassung ersichtlich wird, ist die im Rahmen des BaCaTeC-Programms initiierte Zusammenarbeit mit unseren Partnern in San Diego in seiner ersten Phase sehr erfolgreich angelaufen. Wir werden diese Kooperation nun intensivieren, um weitere detaillierte strukturelle und funktionelle Einblicke in die virale Genexpression zu erhalten. Wir werden hierzu weitere Kooperationen vertiefen oder etablieren, u.a. mit Prof. Bettina Boettcher (Univ. of Edinburgh, UK) und Prof. Henning Urlaub (MPIBC, Göttingen). Beide werden für die strukturellen Studien unentbehrlich sein. Darüber hinaus planen wir eine Zusammenarbeit mit der Firma StemImmune LLC (Richmond, Kalifornien), um nun in größerem Maßstab rekombinante Viren zu generieren und funktionellen Studien zu unterziehen. Schließlich streben wir an, unsere grundlagenorientierte Forschung für die Entwicklung einer neuen Generation von onkolytischen Viren verfügbar zu machen. Die Entwicklung virusbasierter Krebstherapeutika und deren Test in Tieren und Patienten ist eine Schlüsselexpertise des Labors von Prof. Mundt und soll daher zusammen mit dieser Gruppe durchgeführt werden.